توليد انگل تراريخته ژنتيكي ليشمانيا اينفانتوم بيان كننده ژن پروتئين فلورسنت سبز

خلاصه در پرونده يافت نشد به تصوير شرح و توصيف مراجعه شود.

انگل ليشمانيا يوكاريوتي تك سلولي مي باشد كه عامل بيماري ليشمانيوز است. ليشمانيوز مجموعه اي از بيماريهاي انگلي وابسته به ناقل با يك طيف وسيعي از علائم باليني است كه طي آن فاگوسيت هاي تك هسته اي مورد هدف قرار مي گيرند و در نتيجه بقاي انگل درون سلولهاي ماكروفاژ ، كارائي اين سلولها را از بين مي برد. در بررسي هاي تحقيقاتي شيوه هاي مختلفي براي اندازه گيري عفونت ليشمانيا در بافت حيوانات يا در ماكروفاژهاي آلوده بصورت in vitro استفاده مي گردد (نظير مشاهده فرم آماستيگوت انگل با رنگ آميزي گيمسا) كه روشهاي دشوار و وقتگير هستند. اما امروزه استفاده از انگلهاي تراريخت شده بيان كننده ژن هاي گزارشگر براي مشاهده و رديابي سريع و آسان انگلها در بافت يا سلول آلوده در شرايط in vitro و in vivo رايج شده است. ژنهاي گزارشگر ژنهايي هستند كه فنوتيپ قابل سنجش ايجاد مي كنند و به راحتي در بين پروتئين هاي اندوژن قابل تشخيص مي باشند. ژن پروتئين فلورسنت سبز GFP يك پروتئين اتوفلورسنت است و نيازي به سوبسترا ندارد. از ديگر مزيتهاي GFP بر ديگر ژنهاي گزارشگر، سميت پائين، بيان پايدار و آسان و سريع و ارزانتر بودن آن است. پروتئين EGFP شكل جهش يافته GFP تيپ وحشي است كه فلورسنت آن در طول موج هاي بالاتر قابل رؤيت مي باشد و به سلول زنده آسيب وارد نمي كند. در اين طرح، براي نخستين بار در ايران، پلاسميد بياتي خطي شده PLEXSY حاوي EGFP را از طريق نوتركيبي مشابه در لوكوس rRNA S 18كروموزومي انگل ليشمانيا ماژور الحاق (ترانسفكشن پايداري نموديم بطوريكه بيان اين ژن تحت كنترل پروموتر RNA پليمراز قرار گيرد. تائيد ژن فلورسنت در اين انگل توسط ميكروسكوپ فلورسنت و تكنيك وسترن بلات با استفاده از آنتي بادي ضد GFP مورد تأييد قرار گرفت

ذرات شبه ويروسي (VLPs)، نوع كاراي واكسن هاي ساب يونيتي هستند كه ساختار كلي ويروس را بدون ماده ژنتيكي تقليد مي كنند. برخي ويروسهاي بيماريزا نظير آنفلوانزا، HIV و هپاتيت C (HCV) توسط غشاي ليپيدي مشتق از سلول ميزبان به همراه گليكوپروتئين هاي ويروس احاطه شده اند. به دليل خواص ذاتي غشاي ليپيدي، جفت شدن VLP ها در سلولهاي حشرات براي اين ويروسها، نوع متفاوتي از چالشها را نسبت به ويروسهاي ديگر نشان مي دهد. اخيرا، انگل ليشمانيا به منظور توليد برخي پروتئينهاي غشايي، سيتوپلاسمي و آنزيمها بكار برده شده است. اين سيستم داراي ويژگيهاي منحصر به فردي از قبيل توانايي توليد پروتئين شبيه پستانداران (نوع N- گليكوزيلاسيون)، دستكاري ژنتيكي آسان، توليد در مقياس زياد و نياز به مواد غذايي كم مي باشد. در اين پژوهش، توليد و مقايسه ايمني زايي دو نوع ذره شبه ويروسي HCV با استفاده از پروتئينهاي نوكلئوكپسيد Core و ساختاري CoreE1E2 در دو سيستم بياني ليشمانيا تارنتولي انجام شد. نتايج ميكروسكپ الكتروني، ساختارهاي VLP با اندازه اي حدود 30-40 نانومتر تشكيل شده از پروتئينهاي core و 40-60 نانومتر تشكيل شده از پروتئينهاي CoreE1E2 را تأييد كرد. اين ذرات شبه ويروسي توانستند پاسخهاي همورال و سلولي را در مدل موشي بدون نياز به ادجوانت القا نمايند.

ذرات شبه ويروسي (VLP) به منظور طراحي واكسنهاي پيشگيري در عفونتهاي مختلف ويروسي نظير ويروس پاپيلوماي انساني (HPV)، و نيز بكارگيري بعنوان سيستمهاي انتقالي ژن و دارو مورد توجه قرار گرفته اند. دو نوع واكسن تجاري پيشگيري گارداسيل و سرواريكس، بر اساس ذرات شبه ويروسي HPV L1 توليد شده در مخمر و حشره، به بازار عرضه شده اند. با توجه به گزارشهاي موجود، مشكلات عمده اي در بيان و تخليص ذرات شبه ويروسي در سيستمهاي بيان يوكاريوتي نظير حشره و مخمر وجود دارد و همين امر منجر به افزايش قيمت واكسن هاي بر اساس VLP شده است. اخيرا، سيستم جديد يوكاريوتي ليشمانيا تارنتولي به منظور توليد برخي پروتئينهاي غشايي و سيتوپلاسمي بكار برده شده است. اين سيستم داراي ويژگيهاي منحصر به فردي نظير توانايي توليد پروتئين شبيه پستانداران (نوع N- گليكوزيلاسيون)، دستكاري ژنتيكي آسان، توليد در مقياس زياد و نياز به مواد غذايي كم مي باشد. در اين پژوهش، براي اولين بار در جهان، توليد VLP بر اساس پروتئين كپسيد L1 HPV16 در سيستم ليشمانيا تارنتولي انجام شد. ساختار آن با اندازه اي حدود 55-60 كيلودالتون توسط ميكروسكپ الكتروني تأييد شد. بررسي ايمني زايي VLP در مدل موشي C57BL/6 نشانگر تشابه پاسخهاي آنتي بادي با VLP توليد شده در سيستم حشره بود.

در اين اختراع با ساخت و ارائه يك سيستم ميكروفلوئيديك، از طريق اعمال فشرده سازي سلولي انتقال ژن به سلول ها صورت مي گيرد. اين سيستم ميكروفلوييديك شامل ميكروكانال هايي مي باشد كه در اين كانال ها سلول همراه ماده ژنتيكي حركت مي كند. در مقاطعي از كانال قطر كانال از قطر سلول كمتر است كه باعث گير افتادن سلول و اعمال تنش به سلول مي شود. اين سيستم مي تواند باعث ناپايداري غشاء فسفوليپيدي سلول شود در اين ناپايداري عمليات انتقال ژن انجام شود. در اين روش با توجه به اينكه فقط عامل فيزيكي عامل انتقال ژن مي باشد و در آن از مواد شيميايي و حامل هاي ويروسي استفاده نمي شود، مي تواند روشي ايمن براي انتقال ژن به اين نوع سلول ها باشد. سيستم ساخته شده به دليل استفاده نكرده از مواد شيميايي براي سلول سمي نبوده و اين براي اولين بار است كه اين سيستم با عملي ساده براي انتقال ژن با سميت اندك استفاده مي شود و توانايي انتقال ژن آن ارزيابي و تاييد مي شود. در ضمن ساخت آن ارزان است و كار با آن نياز به اپراتور حرفه اي ندارد.